Facendo seguito all’articolo comparso sul nostro Blog il mese scorso “Gli Stati Uniti dovrebbero adottare misure di controllo più strette delle strutture dove si produce seme refrigerato e congelato”, abbiamo pensato che sarebbe stato interessante presentare alcuni dati per dimostrare la variabilità nella qualità del seme congelato che viene importato negli Stati Uniti. Uno dei servizi che offriamo ai nostri clienti è l’analisi post scongelamento del materiale seminale congelato che viene importato; valutiamo la motilità post scongelamento tramite un sistema di analisi computerizzato (CASA), la concentrazione usando un Nucleocounter ed eseguiamo una coltura batterica del seme per valutare la presenza di batteri patogeni per la cavalla. Il risultato di queste analisi permette al proprietario del seme di calcolare il numero di paillette per dose in modo da garantire una dose inseminante che contenga perlomeno il minimo raccomandato dall’industria equina di 200 milioni di spermatozoi progressivamente motili per dose, ottimizzando così le possibilità di concepimento. Inoltre, se il seme importato deve essere distribuito da SBS, esso deve rispettare il nostro requisito minimo raccomandato del 30% di motilità progressiva post scongelamento.
Per gli obiettivi che si poneva questo articolo per il Blog abbiamo incrociato i dati dei campioni inviati dai nostri clienti per l’analisi post scongelamento negli ultimi 3 anni. I dati sono rappresentativi di 21 stalloni da salto il cui seme era stato importato negli Stati Uniti dall’Europa. Nella maggior parte dei casi la valutazione post scongelamento è stata eseguita su più di 1 eiaculato per ciascun stallone, con una media di circa 4 eiaculati analizzati per stallone. Benché ci fosse una variabilità nella qualità tra gli eiaculati, per rappresentare ciascuno stallone nello studio sono stati usati il valore medio di motilità e concentrazione.
Metodo di Analisi
Il protocollo per l’analisi post scongelamento è standardizzato per tutti i campioni, cosa molto importante perché variazioni nel protocollo possono influenzare pesantemente il risultato. È questo il motivo per cui può essere difficile comparare i risultati post scongelamento di due laboratori diversi, perché è probabile che abbiano usato diluitori, tempi di incubazione e metodi differenti (vedi le nostre FAQ: La motilità post scongelamento può variare con il Laboratorio che esegue l’analisi?). Benché potenzialmente difficile da implementare, un protocollo standardizzato per l’analisi post scongelamento potrebbe essere di grande beneficio per tutta l’industria del seme equino congelato.
Subito dopo lo scongelamento (30 secondi a 37°C) il contenuto di ciascuna paillette viene svuotato in una provetta sterile preriscaldata, da cui viene prelevato il campione per l’esame batteriologico. Dopo il prelievo per la coltura batterica, il seme viene mescolato ed una aliquota è utilizzata per la determinazione della concentrazione spermatica e per la valutazione della motilità. Nella maggior parte dei casi per l’analisi viene mescolato il contenuto di due paillette di ciascun eiaculato.
Motilità: il seme scongelato viene diluito con un diluitore preriscaldato a base di latte magro e glucosio ed incubato a 37°C per 30 minuti prima della determinazione della motilità, che viene effettuata su un tavolino riscaldato a 37°Ctramite un sistema computerizzato di analisi CASA. Questo viene fatto per effettuare uno stress test del seme congelato che può rivelare un danneggiamento latente a carico dello spermatozoo causato dal processo di congelamento che potrebbe non essere evidente immediatamente dopo lo scongelamento.
Concentrazione spermatica: viene determinata tramite il ChemoMetec Nucleocounter SP-100. Si tratta di una tecnologia relativamente nuova che conta le cellule attraverso la colorazione del loro DNA nucleare con una sonda fluorescente; possiede una avanzatissima accuratezza ed alta ripetibilità.
Coltura batterica: delle piastre di TSA II 5% sangue defibrinato vengono seminate usando un’ansa da inoculo da 10μL. Un tampone del campione di seme viene conservato per il successivo invio al laboratorio esterno per una eventuale coltura secondaria ed identificazione. Le piastre vengono incubate a 37°C e controllate a 24 e 48 ore per la crescita.
Risultati
Motilità post scongelamento
La motilità progressiva post scongelamento media tra i diversi stalloni era del 31%, con un range da 11 a 53%. In pratica la metà (52%; 11/21) degli stalloni ah mostrato una motilità post scongelamento uguale o maggiore al valore minimo raccomandato dall’industria equina, pari al 30%.
Concentrazione
La concentrazione media tra i diversi stalloni analizzati era di 240 milioni/ml, con un range tra 60 e 540 milioni/ml.
Numero di paillette raccomandato per dose
Il valore medio del numero di spermatozoi progressivamente motili per ciascuna paillette da 0,5ml era 37 milioni, con un range tra 9 e 111. Il numero medio di paillette necessarie per garantire il numero minimo di 200 milioni di spermatozoi progressivamente motili per dose (raccomandato dall’industria equina) era pari a 8. Ciò è di particolare importanza in quanto nella maggior parte dei casi il seme di questi stalloni è solitamente venduto a 2-6 paillette per dose. Solo 5 dei 21 stalloni hanno soddisfatto il requisito minimo dei 200 milioni di spermatozoi progressivamente motili per dose con 4 paillette per dose.
Batteriologia
Dei 21 stalloni, 18 (86%) ha mostrato contaminazione batterica in almeno un eiaculato. Osservando l’incidenza tra tutti i campioni esaminati, il 70% (57/82) ha mostrato contaminazione batterica ed almeno la metà (48%) di questi campioni aveva un elevato grado di crescita batterica. Quindi se uno stallone aveva una contaminazione batterica, questa era generalmente evidente nella totalità o nella maggioranza dei campioni appartenenti a questi stalloni nel gruppo di dati. Solo tre stalloni (14%) non avevano crescita batterica evidente nei campioni di seme congelato sottoposti a QC. I batteri considerati patogeni per la cavalla sono stati isolati dal seme di 2 stalloni (11%). Un elevata incidenza (84%) di contaminazione batterica nei campioni di seme congelato in Europa è stato riportato anche da Corona e Cerchi (2009).
Solo per comparazione, l’incidenza della contaminazione batterica in campioni congelati da laboratori affiliati a SBS è <10%, e solitamente questo è rilevato quando congeliamo con il laboratorio mobile, dove non abbiamo un immediato controllo dell’intero ambiente di raccolta del seme. L’incidenza di elevata crescita batterica nel seme prodotto da SBS è <1% e non abbiamo mai isolato un patogeno per la cavalla negli ultimi 3 anni. Select Breeders è uno dei pochi laboratori nell’industria equina a effettuare coltura batterica su ciascun eiaculato congelato per confermare l’assenza di patogeni per la cavalla. Inoltre sconsigliamo la distribuzione di seme con contaminazione batterica significativa.
Ci sono due possibili fonti di contaminazione batterica per il seme: lo stallone, per esempio derivante dal seme al momento dell’eiaculazione, o una contaminazione derivante dall’ambiente durante la raccolta e la lavorazione del seme, per scarsa igiene e/o attrezzature sporche. I diluitori per il seme contengono antibiotici che dovrebbero eliminare qualsiasi batterio derivante dal seme. Comunque, se la carica batterica è particolarmente elevata, essa può contrastare il livello degli antibiotici nel diluitore. L’elevata incidenza di contaminazione batterica in questi campioni di seme importato riflettono una generale mancanza di controllo qualità durante la raccolta e la lavorazione del seme. Come per la produzione di qualsiasi altro prodotto commerciale, l’introduzione del controllo di qualità aumenta la qualità del prodotto e soprattutto assicura uniformità nella produzione. Per questa ragione è stato creato il Controllo Qualità ed il programma che lo garantisce in tutta la rete di Laboratori Affiliati ad SBS.
Alcuni batteri, come Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, E. Coli, Taylorella equigenitalis e Streptococchi β emolitici, sono noti per essere causa di infezione nella cavalla e ne possono influenzare la fertilità. La presenza di contaminanti, batteri non patogeni, nel seme non è considerata in grado di influenzare la fertilità nella cavalla; comunque bisogna prestare cautela in quelle cavalle suscettibili ad infezioni o infiammazioni uterine post fecondazione. In questi casi, può essere indicata una terapia antibiotica intra uterina. Benché ci siano limitate ricerche sullo stallone, studi in altre specie (montone, toro, verro) dimostrano un declino della qualità e vitalità del seme in presenza di contaminazione batterica. Una ricerca di Ortega - Ferrusola et al (2009) suggerisce che i batteri presenti nell’eiaculato equino possano essere responsabili di alcuni dei danni sub – letali che occorrono agli spermatozoi durante il congelamento. L’influenza della contaminazione batterica sulla qualità e fertilità del seme nel cavallo richiede comunque ulteriori ricerche.
In Conclusione
La qualità del seme congelato importato negli Stati Uniti è molto variabile e possiamo notare che il seme della metà degli stalloni di questo studio non rispettava lo standard minimo raccomandato dall’industria equina del 30% di motilità progressiva post scongelamento. Nell’ambito dei cavalli da salto, gran parte del seme è venduto a dose senza garanzia; quindi il proprietario della fattrice si assume tutti i rischi della fecondazione della cavalla, spesso con spese considerevoli. Quando si importa o si investe una notevole quantità di denaro nell’acquisto di seme congelato raccomandiamo di avere una valutazione indipendente del seme, per confermare l’assenza di patogeni per la cavalla e determinare il corretto numero di paillette per dose da usare per ciascuna fecondazione. Questo può farvi evitare notevoli spese, stress e mal di cuore a lungo termine.
Potresti essere interessato anche ai seguenti FAQs ed articoli:
Il Controllo Qualità è alla base della differenza di SBS
Quale fertilità posso aspettarmi dal seme congelato?
La motilità post scongelamento è correlata alla fertilità?
Puoi avere una cavalla gravida con del seme con motilità progressiva <30%?
Log in to join the conversation.