Il parametro più comunemente usato per valutare la qualità del materiale seminale è la motilità spermatica, in particolare la “motilità progressiva”. Ma cosa significa esattamente e come viene determinata? Il valore minimo di “motilità progressiva” post scongelamento raccomandato per la distribuzione commerciale di materiale seminale congelato è tra il 30% ed il 35%. Questo articolo tratterà alcuni fattori che possono influenzare la motilità spermatica così come i vari problemi associati alle tecniche usate per la determinazione della “motilità progressiva”.
Il problema della motilità soggettiva
Uno dei problemi principali dell’uso della motilità come base per determinare la qualità prevista o addirittura garantita del seme congelato è la variabilità tra i diversi tecnici o laboratori nello stimare soggettivamente la motilità spermatica. Il determinare soggettivamente la motilità spermatica comporta la valutazione visiva al microscopio di diversi campi di spermatozoi motili e la stima della percentuale della popolazione che si muove in modo progressivo. Tecnici esperti addestrati tutti in un unico laboratorio possono diventare molto coerenti tra loro nella stima della motilità progressiva, mentre quando due tecnici di laboratori diversi analizzano il medesimo campione ci può essere una notevole variabilità nei valori riportati. Quando il proprietario di una cavalla acquista del seme congelato, si aspetta che la qualità rispetti lo standard minimo dopo scongelamento. Si aspetta che l’analisi del seme al momento dell’inseminazione confermi la qualità riportata dal venditore o dal laboratorio che ha congelato il materiale seminale. Tuttavia, se questi controlli sono effettuati in modo soggettivo sia dal laboratorio che ha congelato che dal veterinario che insemina, allora possono essere agli antipodi nella loro stima della motilità progressiva. Questo fatto può portare all’insorgere di problemi tra i proprietari degli stalloni ed i proprietari delle fattrici o tra gli agenti che vendono materiale seminale ed i loro clienti.
Il soccorso della Tecnologia
Diversi anni fa, quando lavoravo con gli ingegneri ed i programmatori della Hamilton-Thorn Research allo sviluppo della tecnologia dell’analizzatore computerizzato della motilità spermatica (CASA), mi veniva chiesto quali fossero i parametri di movimento importanti da misurare per l’analisi della motilità spermatica nel cavallo. Questa nuova tecnologia ci ha permesso di tracciare il movimento di uno spermatozoo con notevole precisione e di poter eseguire calcoli su un qualsiasi numero di parametri di questo movimento. Dissi ai programmatori che la percentuale di spermatozoi “progressivamente motili” in un campione era la misura standard per la valutazione della qualità e che essa veniva usata per calcolare le dosi inseminanti. Mi chiesero di definire la “motilità progressiva”. Risposi ciò che mi era sempre stato insegnato e che avevo sempre insegnato agli altri che era “la percentuale di spermatozoi che si muovono in modo relativamente rettilineo ad una ragionevole velocità”. “Bene, quanto rettilineo è relativamente rettilineo e quale velocità è ragionevole e come viene misurata” fu la loro risposta. Quindi l’avvento del sistema CASA richiese una definizione più precisa di quali caratteristiche di movimento distinguevano uno spermatozoo progressivamente motile da uno non progressivamente motile. Usando questi sistemi oggettivi possiamo misurare la reale velocità in microns /secondo di centinaia di spermatozoi in pochi minuti.
La maggior parte dei sistemi misura due o tre tipi di velocità. La velocità curvilinea (VCL) è la distanza coperta nel tempo del percorso effettivo compiuto dalla testa dello spermatozoo, mentre la velocità vettoriale (VAP) è la distanza coperta nel tempo dallo spermatozoo lungo un tracciato ottenuto dalla media matematica di 5 punti in cui esso si trova a passare. La terza misura della velocità, la velocità lineare (VSL) è la distanza lineare retta tra la posizione iniziale della testa dello spermatozoo nel primo frame dell’analisi e quella finale nell’ultimo rispetto al tempo fissato per l’analisi stessa. Possiamo anche misurare quanto sia lineare il tragitto di queste cellule rispetto al tempo impiegato. Questa misura è chiamata “percentuale di rettilineità” (percent straightness o STR) o percentuale di linearità (LIN). STR è il rapporto tra velocità lineare (VSL) e la velocità vettoriale (VAP) espressa come percentuale e la LIN è il rapporto tra VSL e VCL. Il diagramma sotto illustra un tragitto teorico di uno spermatozoo e come i parametri vengono calcolati. Quindi quando si usa un sistema di misurazione della motilità spermatica oggettivo invece di uno soggettivo non ci dovrebbero essere discrepanze tra due laboratori che usino entrambi lo stesso sistema CASA per la determinazione della motilità progressiva. Sfortunatamente non sempre è così. La motilità spermatica effettiva può essere influenzata da una serie di fattori come la curva di scongelamento, il tipo di diluitore utilizzato per diluire il campione, il tempo di incubazione e la temperatura, il tipo di vetrino o di camera utilizzato per esaminare il campione e la temperatura del tavolino del microscopio. Ci sono anche una serie di fattori riconducibili al metodo di utilizzo degli strumenti che non influenzano la motilità spermatica effettiva ma possono influenzare in modo significativo i risultati dell’analisi e la misurazione della motilità progressiva. Questi comprendono: la concentrazione degli spermatozoi nel campione, la selezione dei campi per l’analisi, il numero di frame analizzati, la velocità dei frame ed i valori limite per la VAP e la STR che vengono usate per “definire” la motilità progressiva. Nel nostro sistema CASA ed in tutti i sistemi utilizzati dai laboratori affiliati ad SBS, uno spermatozoo progressivamente motile è definito come quello che ha una velocità (VAP) ≥ 50 mic/sec ad una percentuale di rettilineità (STR) ≥ 75%. Altri laboratori possono tarare i loro sistemi CASA in modo da avere maggiori o minori requisiti per uno spermatozoo per essere considerato progressivamente motile. Per esempio, alcuni laboratori usano una soglia molto minore (≥30 mic/sec per la soglia minima di VAP e 50% per il limite minimo di STR). Un campione di cui un laboratorio A riporta un 40% di motilità progressiva (usando i parametri meno stretti) può essere analizzato dal laboratorio B (usando parametri più stretti) e portare ad una notevole differenza in merito al valore di motilità progressiva. Questo valore può essere molto sotto al 30% anche se viene esaminato esattamente lo stesso campione ed usando lo stesso sofisticato sistema CASA. Per questa ragione è importante che il confronto tra i report di motilità spermatica determinati dal sistema CASA di due laboratori differenti, sia accompagnato dalla descrizione dei setup utilizzati. Bisogna anche considerare che ci sono altre fonti di variabilità che non possono essere controllate. Anche quando due paillette dello stesso eiaculato sono scongelate separatamente ed analizzate separatamente con lo stesso sistema CASA esiste una differenza tra paillette e paillette tale che ci possiamo aspettare un 5-7% di variabilità della motilità progressiva tra le singole paillette dello stesso eiaculato.
Il limite minimo
È una fortuna per quelli come noi che lavorano con gli spermatozoi, che questi siano delle cellule motili. Sappiamo che uno spermatozoo morto non è motile e che quando gli spermatozoi sono danneggiati può essere influenzata la natura del loro movimento. Sappiamo anche che la motilità è necessaria per la fertilizzazione e che gli stalloni i cui spermatozoi mostrano una elevata percentuale di spermatozoi progressivamente motili nell’eiaculato tendono ad avere una maggiore fertilità rispetto a quelli con motilità progressiva inferiore. Misurare la qualità della motilità spermatica prima e dopo la processazione (refrigerazione o congelamento) ci da una indicazione di quanto la popolazione di spermatozoi sia sopravvissuta allo stress del procedimento. Tuttavia, la motilità è solo un indicatore della buona salute cellulare che può essere facilmente osservata e misurata. La fertilizzazione è un processo complesso che coinvolge numerosi attributi funzionali di spermatozoo ed oocita. Alcuni di questi li possiamo misurare ma la maggior parte no. Questo è il motivo per cui alcuni stalloni con una produzione spermatica apparentemente normale ed una qualità accertata con tutti i test di laboratorio a nostra disposizione, sono infertili. Questi stalloni hanno delle mancanze in uno o più di quegli attributi funzionali che non possiamo misurare o non sappiamo nemmeno che esistono. Quindi un campione con motilità progressiva post scongelamento >30% certamente non è garantito avere alcuno specifico livello di fertilità. Allo stesso modo un campione con una motilità inferiore al 30% potrebbe avere una fertilità abbastanza buona se nella dose è contenuto un adeguato numero di spermatozoi. Quindi quale valore esiste per misurare la motilità spermatica post scongelamento e che cerchi di dare uno standard minimo per la qualità post scongelamento di seme utilizzato a scopi commerciali? Lo scopo è eliminare la maggior parte di stalloni che non congelano bene o campioni di scarsa qualità che circolano in commercio. Se il campione ha una motilità post scongelamento molto bassa è molto probabile che abbia una bassa fertilità rispetto ad un campione con motilità post scongelamento molto alta. Il valore del 30% è un numero arbitrario e può accadere che un campione con il 25% di motilità progressiva possa avere la stessa fertilità di uno con il 35%. Un campione che ha una bassa motilità progressiva dopo congelamento e scongelamento è probabile sia più danneggiato di uno che conserva gran parte della sua motilità attraverso tutto il procedimento. Eliminando il seme di bassa qualità dalla distribuzione commerciale massimizziamo le possibilità di successo. L’uso di un sistema oggettivo per determinare la motilità spermatica come il CASA riduce la variabilità nella stima della motilità dovuta a valutazioni soggettive. In quanto “industria equina” dovremmo cercare di aderire a degli standard minimi di qualità post scongelamento per il seme usato in un programma commerciale per proteggere e garantire tutte le parti coinvolte.
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