La morte improvvisa di uno stallone è un evento devastante, non solo emotivamente, ma potenzialmente anche dal punto di vista economico. In aggiunta a qualsiasi obiettivo sportivo lo stallone stesse lavorando, la sua morte prematura potrebbe significare la perdita di future monte, in particolare se non è stato prodotto e stoccato del seme congelato mentre era vivo. In questa situazione può essere possibile raccogliere e congelare gli spermatozoi dell'epididimo dallo stallone castrandolo subito dopo la morte o l'eutanasia. In alternativa, raccolta e congelamento del materiale seminale dell'epididimo può essere una procedura d’elezione eseguita al momento della castrazione. Questo offre un vantaggio per giovani stalloni, vale a dire che può essere congelato del materiale seminale senza togliere tempo ad un fitto programma di addestramento o senza esporre un giovane stallone all'ambiente di monta. Per lo stallone maturo rappresenta un'ulteriore opportunità per raccogliere del seme per il congelamento. Qui passiamo in rassegna il processo di raccolta degli spermatozoi dall'epididimo per il congelamento , e la sua successiva applicazione ai fini della riproduzione.
Cos’ è l'Epididimo?
L’ epididimo può essere pensato come una struttura di magazzinaggio per gli spermatozoi prima dell'eiaculazione ed è composto da tre sezioni - Caput (testa) , corpus (corpo) e cauda (coda). Come si può vedere nella figura 1 (a destra) l'epididimo si trova sopra al testicolo , la testa è relativamente piatta , ha una forma a "J" ed è strettamente collegato alla parte anteriore del testicolo, il corpo è una struttura cilindrica debolmente attaccata alla superficie dorsale del testicolo , e la coda dell’ epididimo è grande e a forma di bulbo, lassamente collegato alla parte posteriore del testicolo. I condotti deferenti del testicolo entrano nella parte prossimale della testa dell’ epididimo e convergono per formare un unico dotto, il condotto dell'epididimo , che continua attraverso la testa, il corpo e la coda. Il condotto dell'epididimo può essere lungo 70- 80m e segue un andamento tortuoso di pieghe e spire, in particolare nella coda dell’ epididimo, dove poi esce e diventa continua con il dotto deferente , o vas deferens, che procede attraverso il funicolo spermatico fino all’ uretra pelvica .
Il tempo di transito degli spermatozoi attraverso l'epididimo è di circa 8-11 giorni , in questo periodo subiscono una significativa maturazione . Quando passano attraverso l’epididimo il fluido viene riassorbito e l'epididimo stesso fornisce proprie secrezioni , influenzando le proprietà della membrana degli spermatozoi. Gli spermatozoi che lasciano il testicolo sono immotili e incapaci di fecondare , però dal momento in cui raggiungono la coda dell'epididimo acquistano la capacità di fecondare. Circa il 60 % degli spermatozoi che si trova nel sistema di dotti in uscita (ossia dall'uscita del testicolo attraverso il dotto deferente) si trova nella coda dell'epididimo, quindi questo è un serbatoio significativo di sperma potenzialmente fertile che può essere prelevato .
Preparazione dei testicoli per il prelievo epididimale
Generalmente il momento dell’ eutanasia è spesso inaspettato ed il luogo potrebbe non essere adatto per la successiva lavorazione post mortem dei tessuti o per il congelamento del materiale seminale. Se lo stallone non può essere trasportato in un idoneo centro di lavorazione prima della castrazione o eutanasia , allora sarà necessario trasportare i testicoli in un laboratorio di processazione. Anche se questo è un momento stressante è importante essere preparati e comunicare al centro di lavorazione, idealmente prima dell’eutanasia e / o castrazione , istruzioni specifiche in modo che possono essere preparati a ricevere e lavorare i tessuti. Una rimozione appropriata dei testicoli, il confezionamento ed il trasporto possono avere una grande influenza sul risultato della procedura, quindi è importante essere preparati per ottimizzare il più possibile questo processo.
In generale, entrambi i testicoli e gli epididimi vengono rimossi con le procedure standard di castrazione chirurgica. Si deve prestare attenzione di lasciare intatti la coda dell'epididimo e la maggior parte dei vasi deferenti associati ad ogni testicolo. Idealmente il dotto deferente deve essere reciso il più in alto possibile e legato per evitare la perdita di materiale seminale . Ciascun testicolo ed epididimo deve essere risciacquato con soluzione salina e messo in un sacchetto di plastica o un guanto da esplorazione rettale. Per il trasporto i testicoli dovrebbero essere conservati refrigerati , confezionati in un contenitore isolato con panetti di ghiaccio (non usare il ghiaccio secco). Una mezzo da trasporto ideale è l’ Equitainer utilizzato per le spedizioni di seme refrigerato . Proprio come si farebbe per le spedizioni di seme refrigerato, bisogna mettere le coolant cans nella parte inferiore dell’ Equitainer e poi sopra il sacchetto che contiene i testicoli. Sia che si utilizzi un Equitainer o una scatola di trasporto alternativa, bisogna avvolgere il sacchetto con i testicoli in un asciugamano in modo che non siano a contatto diretto con i panetti di ghiaccio, impedendo così il congelamento del tessuto . La maggior parte dei centri di processazione preferirebbe ricevere i testicoli il più presto possibile , idealmente entro 24 ore della castrazione . Se è disponibile la spedizione con consegna nello stesso giorno per via aerea, è un'opzione che può essere utilizzata per ridurre il tempo di transito .
Un altro vantaggio di comunicare con il centro di lavorazione prima dell’ eutanasia o la castrazione è quello di rivedere lo stato sanitario dello stallone . Per lo stoccaggio e la distribuzione sono necessari i test per l’Arterite Virale Equina (EVA), l’Anemia Infettiva Equina (AIE), il Morbo Coitale Maligno (MCM), la Rinopolmonite (EHV), la Morva e la Metrite Equina Contagiosa (CEM) effettuati prima dello stoccaggio e la distribuzione del seme congelato. Il protocollo di bio - sicurezza standard dovrebbe essere quello di prelevare il sangue dallo stallone donatore per i test di Anemia Infettiva Equina e Arterite Virale Equina, il Morbo Coitale Maligno, la Rinopolmonite, e idealmente di prelevare tamponi dell'uretra e fossa uretrale per il test della Metrite Equina Contagiosa. Questi campioni possono essere prelevati prima dell’eutanasia o al momento della castrazione. Ciò può impedire restrizioni impreviste sullo stoccaggio e la distribuzione del materiale seminale dopo la lavorazione, ed un potenziale focolaio di malattia, se il seme contaminato viene utilizzato in un programma di inseminazione artificiale. E 'pratica responsabile per il proprietario di uno stallone utilizzare in un programma commerciale di inseminazione artificiale solo materiale seminale il cui stato sanitario è noto.
Raccogliere il materiale seminale dall'Epididimo
All'arrivo presso il centro di processazione, l'epididimo dovrebbe essere dissezionato dal suo testicolo. La coda dell'epididimo ed i vasi deferenti collegati sono poi sezionati dal resto dell'epididimo (cioè il corpo e la testa), vedi foto a sinistra .
Ci sono due metodi di base per l'estrazione degli spermatozoi dall'epididimo, sia tramite il lavaggio retrogrado degli spermatozoi attraverso l'epididimo o utilizzando il metodo " float- up". In quest'ultimo metodo, i vasi deferenti e la coda dell'epididimo sono collocati in piastra di Petri (o piastra per la ricerca degli embrioni), con del diluitore per seme o altro mezzo appropriato di diluizione. Il tessuto è inciso in più posizioni e la piastra agitata per favorire il rilascio degli spermatozoi dal tessuto nel diluitore. Ad SBS preferiamo il metodo di lavaggio , soprattutto perché mediante lavaggio retrogrado sono generalmente ottenuti più spermatozoi che con il metodo float up. Inoltre fornisce un volume più concentrato di spermatozoi, quindi meno a rischio di contaminazione dal sangue o dal tessuto. Per il metodo di lavaggio retrogrado il lume dei vasi deferenti è cateterizzato e si inserisce una siringa contenente diluitore per seme (o un appropriato mestruo di diluizione). L'epididimo è tagliato a livello della giunzione corpo - coda per consentire al seme di uscire. Il tessuto viene quindi sospeso sopra un tubo di raccolta e la siringa premuta lentamente e con attenzione per lavare lo sperma attraverso la coda dell’epididimo .
Crioconservazione degli spermatozoi epididimali
Una volta raccolti gli spermatozoi da entrambi gli epididimi le soluzioni di materiale seminale vengono unite e viene determinata la concentrazione di spermatozoi al fine di calcolare il rendimento. A seconda della concentrazione o del metodo utilizzato per la raccolta può essere necessaria la centrifugazione. Ad esempio può essere utilizzato un diluitore a base di latte scremato e glucosio per il float up o per il lavaggio retrogrado . In questo caso , lo sperma deve poi essere centrifugato e risospeso in un opportuno diluitore per la crioconservazione. In alternativa, se è stato usato un grande volume di fluidi di lavaggio o se il recupero di spermatozoi è inaspettatamente basso, con conseguente bassa concentrazione di spermatozoi, poi può essere necessaria la centrifugazione per concentrare le cellule al livello appropriato per il congelamento del materiale seminale. Un vantaggio del metodo con lavaggio è che può essere utilizzato come mezzo di lavaggio il diluitore per congelamento, eliminando così la necessità della centrifugazione .
Una volta risospeso nel diluitore per congelamento il processo di crioconservazione continua proprio come per gli spermatozoi ottenuti da un eiaculato, cioè il seme viene caricato nelle paillette da 0,5 ml e congelato utilizzando un congelatore computerizzato programmabile o un sistema di congelamento passivo su vapori di azoto. Uno svantaggio del congelamento dello sperma dopo la raccolta dall'epididimo è che il seme dallo stallone potrebbe non essere mai stato congelato prima. Di conseguenza, non è noto come il seme dello stallone risponderà al processo di congelamento ed il test di congelamento standard del primo eiaculato , utilizzato per identificare il diluitore di congelamento che funziona meglio per quel particolare stallone , non può essere eseguito. Tuttavia può essere scelto un idoneo diluitore di congelamento che offra le migliori possibilità di successo, potrebbe non essere la scelta ottimale per quel particolare stallone, ma in genere possono essere ottenuti risultati soddisfacenti.
Quante dosi posso sperare di ottenere ?
Il numero di spermatozoi che può essere recuperato dai due epididimi di uno stallone è in genere maggiore di quello di un eiaculato normale dello stesso stallone. Le due code degli epididimi di uno stallone normale , a riposo sessuale, dovrebbero contenere circa 50 miliardi di spermatozoi. Tuttavia, la produzione di spermatozoi è altamente variabile tra stalloni ed è direttamente correlata alla dimensione dei testicoli. Di conseguenza, uno stallone che normalmente produce 4-5 miliardi di spermatozoi in un eiaculato avrà meno spermatozoi conservati in un epididimo rispetto a uno stallone che eiacula in genere 10-12 miliardi di spermatozoi. Anche la frequenza di eiaculazioni prima della raccolta può influenzare il numero di spermatozoi totali recuperati dall'epididimo, ad esempio, uno stallone prelevato su base giornaliera prima della raccolta epididimale avrà meno spermatozoi nel serbatoio epididimale che se fosse stato sessualmente a riposo. Pertanto, ci si potrebbe aspettare un range tra le 5 e le 50 dosi inseminanti ottenute da un paio di testicoli .
La qualità e la motilità degli spermatozoi ottenuti dopo la raccolta epididimale di solito è buona per stalloni normali dal punto di vista riproduttivo, ma dipende naturalmente dalla qualità dello sperma intrinseca per quel particolare stallone. Ad esempio, la procedura ha meno probabilità di successo se lo stallone ha avuto una malattia prolungata o ha subìto una riduzione della qualità del seme e / o della fertilità correlata all'età prima della morte . Il successo della procedura può anche essere influenzato dalla temperatura e dal tempo di arrivo fino al centro di processazione , oltre che dalla bravura del tecnico nel preparare il tessuto e nel raccogliere gli spermatozoi. Il successo della crioconservazione è a sua volta influenzato dalla bravura del tecnico , le attrezzature e la tecnologia utilizzate per la lavorazione e su quanto bene il materiale seminale dello stallone risponde alla pro cessazione ed al congelamento.
Fertilità degli spermatozoi epididimali
La prima gravidanza con spermatozoi congelati e scongelati di stallone è stata di fatto ottenuta con spermatozoi epididimali nel 1957. Da allora sono state confermate gravidanze ottenute con spermatozoi congelati e scongelati raccolti dall'epididimo, lavorati ed inseminati in loco, o dopo trasporto refrigerato del testicolo in un luogo separato per la processazione e la successiva spedizione di seme congelato per l'inseminazione della cavalla. Tuttavia, la fertilità degli spermatozoi epididimali congelati - scongelati è generalmente ritenuto inferiore rispetto a quella di spermatozoi eiaculati congelati e scongelati. La ragione principale di ciò è che gli spermatozoi subiscono una maturazione costante passando attraverso l’epididimo, questa maturazione continua ed è influenzata dall'esposizione al plasma seminale al momento dell'eiaculazione, inoltre la maturazione continua dopo l’introduzione e l'interazione con il tratto genitale femminile. L’estrazione degli spermatozoi dall'epididimo essenzialmente elimina la possibilità degli spermatozoi di essere influenzati dal plasma seminale al momento dell'eiaculazione . Per compensare questo spesso viene aggiunto del plasma seminale agli spermatozoi epididimali prima del congelamento, o al momento della fecondazione (vedi sotto). Il tasso di gravidanza con spermatozoi epididimali congelati - scongelati può essere ottimizzato mediante l'uso di tecniche di riproduzione assistita come inseminazione a basse dosi guidata per via rettale o inseminazione uterina profonda isteroscopica o l’ intracytomplasmic sperm injection (ICSI) .
L'aggiunta di plasma seminale
I vantaggi proposti aggiungendo il plasma seminale agli spermatozoi dell'epididimo sono i seguenti :
- Gli spermatozoi raccolti dall'epididimo perdono l'occasione di essere esposti al plasma seminale al momento dell'eiaculazione e la loro maturazione può quindi essere compromessa .
- È noto che una piccola percentuale di plasma seminale nel volume di seme introdotto nella cavalla può contribuire a mitigare la risposta infiammatoria dell'utero all’ inseminazione.
Il plasma seminale potrebbe essere preparato e congelato dallo stesso stallone, se possibile, o più frequentemente sono preparate e congelate delle aliquote di plasma seminale dall’eiaculato di uno stallone diverso con seme di buona qualità e fertilità nota. Plasma seminale può essere aggiunto al diluitore per congelamento prima del congelamento di spermatozoi epididimali. In alternativa , plasma seminale può essere utilizzato come liquido di lavaggio durante la raccolta degli spermatozoi con il metodo di lavaggio retrogrado, seguita da una successiva diluizione con diluitore per congelamento. Se gli spermatozoi dell'epididimo non sono stati congelati in presenza di plasma seminale, esso potrebbe essere aggiunto al seme dopo scongelamento, consentendo un periodo di esposizione prima dell’ inseminazione. I risultati in letteratura sono inconcludenti ; alcuni studi riportano un miglioramento della fertilità con l'aggiunta di plasma seminale , mentre altri no . Tuttavia, non è considerato dannoso e quindi dati i potenziali benefici la maggior parte dei professionisti aggiunge, se disponibile, del plasma seminale. In generale , la percentuale di plasma seminale aggiunto in questi casi è circa il 5 %.
Se siete interessati a saperne di più circa il congelamento degli spermatozoi dell'epididimo o richiedere l'uso di questo servizio in qualsiasi momento in futuro , contattate Select Breeders Services per ulteriori informazioni (0039-0525420142 , info@sbsitaliasrl.com).
Figura 1: Pickett BW et al, (1989) Management of the Stallion for Maximum Reproductive Efficiency, II. Animal Reproduction Laboratory Bulletin No. 5. Fort Collins, Colorado State University.
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