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La Crioconservazione degli Embrioni Equini

February 16, 2015

Posted by SBSI in Gestione Della Fattrice

Il termine “vitrificazione” dell’embrione non suona molto come "congelamento" dell’embrione , ma il prodotto finale è di fatto un embrione equino congelato in azoto liquido per la conservazione della genetica ed il trasferimento in una cavalla ricevente in un secondo momento. A beneficio di alcuni lettori di questo blog, ricordo che un embrione è il risultato della fecondazione di un ovocita (ovulo) con uno spermatozoo e delle fasi iniziali di sviluppo. La vitrificazione di un embrione è il processo mediante il quale gli embrioni equini vengono congelati per la conservazione per periodi di tempo indefiniti prima del trasferimento in una cavalla ricevente. Possediamo la tecnologia per criopreservare spermatozoi ed embrioni equini, ma non gli ovociti equini. Qui sta la risposta alla domanda più comune che si apre in una conversazione su questo blog. Alcuni lettori danno per scontato che poiché possiamo congelare lo spermatozoo generato dal maschio, possiamo congelare pure l’ovocita generato dalla femmina. Purtroppo, a causa di alcuni componenti molto sensibili del citoscheletro negli ovociti, non esiste una tecnica per congelare ovociti equini. Procedendo, capirete il processo di vetrificazione dell'embrione ed approfondiremo le aree di ricerca che stanno migliorando i tassi di successo degli embrioni vitrificati nel generare puledri vivi.

Perché Congelare Embrioni Equini?

Embryo Vitrification_Embryo Prima di tutto, perché la crioconservazione degli embrioni è una procedura così ricercata? Beh, avendo un embrione congelato, non solo preserviamo il potenziale genetico di valore di una particolare combinazione di fattrice e / o di stallone, ma permettiamo anche una facile gestione delle riceventi eliminando la necessità di una sincronizzazione tra la donatrice e la ricevente al momento del recupero dell’ embrione. Possiamo usare una ricevente specifica per una particolare donatrice e anche utilizzare la donatrice stessa per portare la gravidanza in un secondo momento quando la gravidanza può essere più vantaggiosa. La vitrificazione degli embrioni permette anche di facilitare l’ importazione o l'esportazione della genetica sotto forma di embrioni, invece di cavalli vivi. Infine, alcune tecniche riproduttive avanzate come la Intracitoplasmatic Sperm Injection (ICSI) di follicoli aspirati per via transvaginale (vedi il nostro articolo del blog L'Ovum Pickup nella cavalla), possono produrre più potenziali embrioni di quelli che un cliente può desiderare di avere per ogni stagione di monta. Con la vitrificazione e la conservazione di più embrioni, possono essere realizzate gravidanze in più stagioni di monta.

Il Procedimento di congelamento di Embrioni Equini

La crioconservazione di qualsiasi cellula richiede che si verifichino tre processi per avere un prodotto di successo e vitale. Prima di tutto, l'acqua intracellulare deve essere rimossa dalla cellula, in modo che quando l'acqua congela, non si espanda e rompa il doppio strato fosfolipidico fragile della membrana cellulare. In secondo luogo, occorre impedire la formazione di cristalli di ghiaccio nel fluido esterno alla cellula che possono causare rottura o schiacciamento della cellula. In sostanza bisogna lasciare spazio tra i cristalli di ghiaccio perché le cellule vi rimangano sospese senza essere schiacciate. Infine, dobbiamo assicurarci che i crioprotettori non inducano cambiamenti osmotici letali, siano tossici per le cellule di interesse, e che il processo di raffreddamento/scongelamento ottimizzi la buona salute della membrana cellulare.

Sembra semplice vero? Beh, un embrione equino non è solo una normale cellula. In realtà, quando recuperiamo l'embrione al giorno 6,5 dopo l'ovulazione, non è una singola cellula. L'embrione può contenere centinaia di cellule, circondate da una capsula glicoproteica, la zona pellucida, e in alcuni casi contiene una cavità in corso di formazione (blastocele) piena di fluido. Rispetto a un singolo spermatozoo, l'enormità degli embrioni equini al giorno 6.5 è impressionante. Le differenze tra uno spermatozoo individuale ed una morula da 150 a 250μm, rispetto ad un embrione con ~ 500 cellule rendono impossibile il confronto. Parimenti, non possiamo trattarli allo stesso modo quando si tratta di crioconservazione. Nel tardo 1990 la vitrificazione si è dimostrata superiore rispetto al congelamento lento che usiamo per la crioconservazione degli spermatozoi e di altre linee cellulari.

Embryo Vitrification_Dehydrated Embryo La vitrificazione è la formazione di vetro a basse temperature senza formazione di cristalli di ghiaccio. Significa produrre un solido, ma così in fretta, che non si formano cristalli di ghiaccio. Per eseguire questa operazione, è necessaria un tasso di raffreddamento veloce nell'intervallo di -15-30° C per minuto. Lo svantaggio, tuttavia, è che per tollerare tale elevato tasso di raffreddamento, la concentrazione di crioprotettori (CP) entro l'embrione deve essere molto elevata e vicino a livelli tossici. Cerchiamo di limitare la tossicità dei crioprotettori utilizzandone diversi tipi e aumentando la concentrazione gradualmente, esponendo l'embrione ai livelli più tossici solo per il lasso di tempo minimo.

In commercio, ci sono kit pronti all’uso contenenti soluzioni di crioprotettori in diverse concentrazioni, ed una soluzione di diluizione a base di zucchero per lo scongelamento. Questi kit utilizzano un aumento graduale della concentrazione di glicerolo e glicole etilenico per rimuovere l'acqua intracellulare e disidratare l'embrione. Purtroppo, con qualsiasi protocollo di vitrificazione, il tempo di esposizione ai crioprotettori è molto, molto importante. Se l’embrione rimane troppo a lungo in qualsiasi soluzione, l'alta concentrazione di crioprotettore lo ucciderà. Se vi rimane troppo poco tempo e non si verifica l’ equilibrio, l’ acqua intracellulare che rimane ucciderà l'embrione una volta vitrificata.

I Kit commerciali richiedono anche l'uso di paillette da 0,25 ml sterili per il carico dell'embrione nella soluzione di vitrificazione con la massima concentrazione di crioprotettore. Per questo, si aggiungono due colonne di diluitore a base di zucchero per contribuire a rimuovere i crioprotettori tossici al momento dello scongelamento della paillette. L'uso di una paillette da 0,25 ml può sembrare un piccolo volume, ma nel mondo della vetrificazione, è una quantità enorme. Basta guardare il recente clima freddo che abbiamo avuto qui, sulla costa orientale. Che cosa rischia di congelare più veloce, il serbatoio da 150 litri o la pozza sottile fuori della mia porta di casa? Il volume di una paillette da 0,25 ml, immersa in azoto liquido (-196°C) raffredda solo a -2.5°C per minuto. Questo è piuttosto lontano dal tasso di raffreddamento raccomandato che supera -15°C al minuto per una adeguata vitrificazione.

Embryo Vitrification_VIT Procedure Questi kit funzionano, e per gli embrioni più piccoli <300μm di dimensione, sono stati segnalati tassi di gravidanza di embrioni vetrificati e poi trasferiti che si avvicinano al 75%. Questo tasso del 75% si avvicina quello che ci aspettiamo per embrioni freschi, dove il maggior successo del trasferimento supera l'80%. Per gli embrioni superiori a 300μm di dimensione, i tassi di successo sono notevolmente inferiori.

Congelamento Embrioni Grandi

La vitrificazione di embrioni più grandi non è una tecnica praticabile a causa del basso tasso di successo del trasferimento. Già la gestione delle cavalle per recuperare embrioni quando sono <300μm richiede tempi precisi di ovulazione in modo da lavare la cavalla per il recupero dell’ embrione 6,5 giorni più tardi. Facciamo questi lavaggi anticipati nel tentativo di ottenere embrioni piccoli. Sappiamo che l'embrione lascia l'ovidotto ed entra nell'utero intorno al giorno 5,5. Tuttavia, siamo costretti a perdere gli embrioni che hanno un ritardo nella entrare nell'utero. Ad aumentare la difficoltà è la rapida crescita di un embrione equino in questa fase di sviluppo. Anche un ritardo di 8-12 ore con un flusching può fare la differenza nel recuperare un embrione di dimensioni adeguate contro uno troppo grande per la vitrificazione.

Sono state sviluppate tecniche in laboratorio con l’uso di microscopi con micromanipolatori, sistemi di conservazione dell’embrione, ed attrezzi specifici (Piezo Drill) per fare piccoli fori nell'embrione per aiutare a bypassare la capsula che impedisce l'afflusso di crioprotettori e che aiuta a rimuovere dal blastocele ulteriore fluido che compromette il successo della vitrificazione di embrioni grandi. Queste tecniche sono promettenti non solo per migliorare il successo della vitrificazione degli embrioni più grandi, ma anche perché permettono lo screening dell'embrione per le malattie genetiche e la determinazione del sesso. Tuttavia, l'attrezzatura necessaria esiste solo in pochi centri specializzati in tutto il paese e nel mondo. L'esperienza dell’operatore per eseguire queste procedure influenza direttamente i risultati di successo.

Conclusioni

Infine, ci sono due aree in cui abbiamo fatto importanti progressi nel successo della vitrificazione dell'embrione. La prima è nell’ambito della buona scienza mentre la secondo è un po’ casuale. Come ho detto prima, le paillette da 0,25 ml sono un grande volume da vitrificare. Diminuendo il volume oltre ad aumentare la superficie, si può aumentare notevolmente la velocità di raffreddamento della procedura. Utilizzando un disco sottile (CryoLoop) o sottili paillette pressate ci permette di ridurre la quantità di materiale di vitrificazione che circondano l'embrione. Nel caso del CryoLoop, l'embrione viene sospeso in una pellicola sottile di crioprotettore e vitrificato. Quando si usano le paillette schiacciate, il volume di liquido è molto basso, e permette una velocità di raffreddamento più appropriato. Utilizzando il CryoLoop o le paillette schiacciate, scongeliamo l'embrione direttamente in una soluzione di diluizione calda a base di zucchero per diminuire la concentrazione di glicole etilenico e glicerolo. Questi passaggi hanno aumentato il successo del trasferimento degli embrioni scongelati-trasferiti.

Negli embrioni equini prodotti in laboratorio (in vitro), tramite ICSI non si forma la capsula. La capsula glicoproteica è uno dei principali ostacoli per l'ingresso dei CP negli embrioni di equidi. Quindi con una combinazione di mancanza della capsula e attenta valutazione (giornaliera) delle dimensioni, della morfologia e della fase di sviluppo dell'embrione, gli embrioni prodotti con ICSI vengono vetrificati nel momento preciso in cui la loro dimensione e la fase di sviluppo sono ottimali. Accoppiando questo tempismo perfetto con una mancanza di capsula (e con veterinari preparati in stanze a clima controllato e incontaminate), gli embrioni prodotti tramite ICSI hanno le migliori possibilità di essere vitrificati al momento giusto per risultati ottimali post scongelamento.

Il messaggio da recepire è che anche se la vitrificazione degli embrioni suona come un meraviglioso sistema per generare embrioni da trasferire in un secondo momento, il successo di laboratorio ed il successo nel mondo reale spesso non sono vicini al 100%. Dico ai clienti di aspettarsi un tasso di successo del 75-80% per il trasferimento di embrioni freschi recuperati dalla donatrice. Se dovessimo vitrificare gli stessi embrioni per un successivo trasferimento direi loro di aspettarsi un 50-60% di successo del trasferimento. Vitrificare un embrione diminuirà le probabilità di sopravvivenza di quell'embrione al momento del trasferimento. Altre variabili come l'età della donatrice, la fertilità, e le dimensioni degli embrioni possono influenzare il successo del trasferimento dell'embrione dopo vitrificazione. Spetta a ogni proprietario discutere con il loro veterinario per quanto riguarda i pro ei contro di ogni paziente e determinare ciò che è nel migliore interesse del proprietario, della cavalla, e del futuro puledro.

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