Quanti spermatozoi servono per ottenere una gravidanza?
Uno? 500 milioni? 100 milioni progressivamente motili? 600 milioni di spermatozoi progressivamente motili e morfologicamente normali? Un miliardo? Attualmente non è purtroppo possibile rispondere in modo adeguato a nessuna di queste domande. L’unica risposta che può essere data è……..”dipende”.

La fertilizzazione è un fenomeno particolarmente complesso che vede implicati sia lo spermatozoo che l’oocita; entrambi sono dotati di una miriade di caratteristiche funzionali che devono essere perfettamente efficienti al momento opportuno e nel luogo preposto. E’ inoltre importante sottolineare che uno spermatozoo motile non è necessariamente uno spermatozoo fertile. Quanti spermatozoi devono pertanto essere depositati nell’utero della cavalla per conseguire una fertilità accettabile? Questa dovrebbe essere la base logica per determinare quanti spermatozoi dovrebbero essere contenuti in una dose di materiale seminale che sia commercialmente accettabile. Per questo motivo, l’unico modo per far sì che i proprietari di stallone e fattrice possano raggiungere il loro obbiettivo comune (la gravidanza) è quello che ogni dose di materiale seminale contenga un numero sufficiente di spermatozoi perfettamente efficienti, così da portare al massimo le possibilità di ottenere una gravidanza. La correlazione tra il numero di spermatozoi contenuti in una dose inseminante e la fertilità di uno stallone può essere espressa da una curva (fig. 1) e, nell’esempio raffigurato nel diagramma, il modo in cui si sviluppano le curve ed il livello massimo di fertilità sono differenti per i quattro stalloni presi in considerazione.

Nella figura 1, lo stallone A arriva ad ottenere la massima fertilità con un numero di spermatozoi inferiore rispetto agli stalloni B, C e D e comunque, anche se si aumentasse il numero di spermatozoi presenti in ogni dose inseminante, non si riuscirebbe ad ottenere alcun incremento della sua fertilità.

Come rappresentato nella fig. 1, la dose inseminante appropriata per lo stallone A dovrebbe essere di 100 milioni di spermatozoi progressivamente motili. Lo stallone B raggiunge invece un livello superiore di fertilità, ma solo quando si impiegano un numero maggiore di spermatozoi per dose inseminante. Inoltre, nel caso in cui si utilizzasse una dose inseminante di 100 milioni di spermatozoi progressivamente motili per tutti gli stalloni inclusi nel nostro esempio, si otterrebbero percentuali di fertilità molto diverse (53% per A, 42% per B, 32% per C e 15% per D). Aumentando invece il numero di spermatozoi progressivamente motili a 250 milioni per dose inseminante non si osservano cambiamenti per lo stallone A, mentre gli stalloni B e C incrementerebbero notevolmente la loro fertilità. Lo Stallone C potrebbe raggiungere gli stessi valori di fertilità dello stallone A, ma solo nel caso in cui si aumentasse il numero di spermatozoi contenuti in ogni dose inseminante. Lo stallone D, infine, ha un picco massimo di fertilità molto basso, che non può essere incrementato nemmeno utilizzando un numero maggiore di spermatozoi per dose inseminante. Ciò è dovuto al fatto che alcuni difetti delle cellule spermatiche sono compensabili aumentando il numero di spermatozoi presenti in una dose inseminante, mentre altri (come probabilmente quelli degli spermatozoi dello stallone D) non lo sono affatto (vedi riquadro).

Difetti compensabili e non compensabili

“Se il 30% di motilità post-scongelamento è un parametro accettabile ed un campione di materiale seminale possiede il 15%, qual è il motivo per il quale non si può semplicemente raddoppiare il numero di paillette necessarie ad una inseminazione?”. In realtà, per alcuni stalloni è possibile……. ma per altri si può raddoppiare, triplicare od anche incrementare di 10 volte il numero di spermatozoi inseminanti, senza però riuscire ad aumentare in alcun modo la fertilità. Da un’analisi della figura 1, si evince che si potrebbe significativamente aumentare la fertilità degli stalloni B e C raddoppiando il numero degli spermatozoi/dose da 100 a 200 milioni; cosa questa che viceversa non avrebbe alcun effetto sulla fertilità dello stallone D. Ogni campione di seme contiene sempre spermatozoi con alterazioni morfo-funzionali e pertanto la proporzione che esiste fra normali ed anormali nella dose inseminante ne determina la fertilità. Tra i possibili difetti spermatici ve ne sono alcuni molto importanti ed altri che lo sono meno. Ad esempio, alcuni difetti limitano la capacità dello spermatozoo di penetrare l’oocita e quindi di fecondarlo: tali spermatozoi non saranno in grado di partecipare alla fertilizzazione e saranno pertanto incapaci di competere con gli spermatozoi normali presenti nello stesso eiaculato. Questo tipo di difetti viene definito “compensabile” perché si può compensare la fertilità degli spermatozoi aumentando il loro numero, fino a raggiungere una quantità di spermatozoi competenti (capaci di fecondare un oocita) all’interno della dose inseminante.

Viceversa, altri tipi di difetti (quelli non “compensabili”) non impediscono allo spermatozoo di penetrare e fecondare la cellula uovo, ma condizionano gli avvenimenti successivi alla fecondazione e portano ad una morte embrionale precoce. Questi spermatozoi sono in grado di competere con gli spermatozoi “compagni di viaggio” normali e potenzialmente hanno le stesse probabilità di penetrare la cellula uovo. In questo caso, se si aumentasse il numero di spermatozoi presenti nella dose inseminante, non si otterrebbe una maggior probabilità che un oocita possa essere fecondato da uno spermatozoo totalmente competente, visto che la proporzione tra spermatozoi normali ed anormali resta invariato. Pertanto questo tipo di difetto rimane “non compensabile”, in quanto non è possibile migliorare la fertilità aumentando il numero di spermatozoi presenti nella dose inseminante.

Qual è il motivo per il quale il materiale seminale di stalloni differenti può possedere una fertilità totalmente diversa, anche se usato su fattrici gestite nello stesso modo dal punto di vista riproduttivo?

La risposta a questa domanda sta nel fatto che in realtà la fertilità di uno stallone non è semplicemente determinata dal numero totale di spermatozoi impiegati, ma dal numero di spermatozoi in grado di fertilizzare che sono presenti nella dose inseminante. Uno spermatozoo competente (capace di fecondare un oocita) deve possedere tutte le caratteristiche funzionali necessarie alla fertilizzazione. Un esempio è la motilità spermatica, caratteristica funzionale che uno spermatozoo deve avere per essere in grado di fecondare un oocita dopo che è stato introdotto nell’apparato genitale femminile tramite inseminazione uterina. Di conseguenza, per fare in modo che uno stallone con il 30% di motilità spermatica abbia la stessa fertilità di uno con il 60% di motilità, basterebbe che le dosi inseminanti del primo contenessero il doppio di quelle del secondo. Se la motilità fosse l’unico parametro indispensabile che uno spermatozoo deve possedere per fertilizzare un oocita, questo semplice esempio potrebbe anche corrispondere alla verità. Purtroppo però, la realtà non è proprio questa: la misurazione della motilità spermatica, per quanto sofisticata possa essere, non corrisponde alla fertilità. Infatti, uno spermatozoo con scarsa motilità può essere fertile, mentre uno ad elevata motilità può invece non esserlo. Oltre alla motilità progressiva, uno spermatozoo in grado di fecondare, deve anche possedere specifiche caratteristiche morfologiche quali membrane cellulari plasmatiche ed acrosomiali integre che gli permettano di entrare in contatto con l’oocita e di penetrarne la membrana cellulare, od altre ancora non ben definite e parzialmente sconosciute. (vedi fig. 2 per una rappresentazione del concetto).

Figura 2. Supponiamo che uno spermatozoo possegga 7 caratteristiche funzionali che siano necessarie alla fertilizzazione (caratteristiche A-G: A = motilità, B = morfologia, etc.) e che noi, attraverso sofisticate analisi di laboratorio, fossimo in grado di misurare con esatta precisione questi parametri ed in grado di ben distinguere gli spermatozoi normali da quelli anormali. (Questa è chiaramente una semplificazione estrema,visto che vengono presi in considerazione un numero di parametri molto elevato e dei quali oggigiorno poco conosciamo). Se un campione di materiale seminale contenesse sopratutto spermatozoi normali per le caratteristiche A, B, C, D, E ed F ed anormali per G, questo campione dovrebbe essere considerato non fertile; lo stesso sarebbe se un campione contenesse sopratutto spermatozoi normali per le caratteristiche A, B, C, D, E e G ed anormali per F. Se si valutasse solo la caratteristica A, si prenderebbe in considerazione solamente la motilità spermatica, mentre determinare solo motilità e morfologia spermatica significherebbe vagliare solo A e B, e così via. Se si tenesse in considerazione quanto rappresentato nella figura, la maggior parte dei centri di produzione potrebbero identificare il campione come non idoneo solo se il parametro F corrispondesse alla motilità o alla morfologia. Essere in grado di prevedere la fertilità del materiale seminale, significa avere la possibilità di misurare e valutare tutti le caratteristiche funzionali degli spermatozoi. Purtroppo però, dopo aver identificato le procedure per valutare una nuova caratteristica funzionale, l’unico obiettivo realizzabile è quello di provare e vedere se i campioni di materiale seminale appartenente a vari stalloni possano essere sub-fertili a causa dell’anormalità di questa caratteristica funzionale.

La maggior parte dei centri di produzione di materiale seminale congelato producono le dosi inseminanti basandosi sul numero di spermatozoi progressivamente motili presente allo scongelamento ed in alcuni casi prendono in considerazione anche la percentuale di spermatozoi morfologicamente normali. Nonostante tutto però, anche l’utilizzo di un numero adeguato di spermatozoi che posseggano queste due caratteristiche funzionali non garantisce che questa dose inseminante sia fertile. L’utilizzo di una dose di materiale seminale che contenga, post-scongelamento, un numero adeguato di spermatozoi progressivamente motili e morfologicamente normali riduce solamente al minimo la probabilità che l’infertilità sia il risultato di anormalità di questi due attributi (vedi fig. 2 per una rappresentazione del concetto). Un’ulteriore metodo che si utilizza per standardizzare la qualità del seme è quello di valutarla nel modo più preciso ed accurato possibile, impiegando procedimenti di laboratorio standardizzati. Il seme congelato è solitamente venduto con la garanzia (o diritto di non-garanzia) che, dopo lo scongelamento, ogni dose inseminante contenga almeno un numero x di milioni di spermatozoi totali che abbiano una percentuale x di motilità progressiva.

In molti laboratori dove viene prodotto materiale seminale congelato, la motilità viene valutata attraverso la stima soggettiva del numero di spermatozoi che attraversano linearmente il campo di visualizzazione del microscopio. E’ chiaro che una stima della motilità spermatica effettuata in questo modo, proprio per la sua soggettività, viene estremamente influenzata dall’esperienza di chi analizza il campione ed è molto meno precisa di una valutazione eseguita impiegando un sistema computerizzato (CASA, Computer Assisted Semen Analysis). Un altro fattore fondamentale per arrivare a determinare il numero preciso di spermatozoi che saranno contenuti nella dose inseminante, è la metodica con cui viene effettuata la misurazione iniziale e post-diluizione della concentrazione spermatica. Una scarsa accuratezza nella fase di conta degli spermatozoi o l’utilizzo di strumenti inappropriati, portano inevitabilmente ad ottenere una concentrazione spermatica non adeguata a quella che dovrebbe essere contenuta nella dose inseminante. (Per avere ulteriori informazioni sulle metodiche che i laboratori Select Breeders Services utilizzano per assicurare il più elevato standard di qualità possibile, si consiglia di far riferimento all’articolo pubblicato sulla newsletter pubblicata nel Autunno 2006.

Idealmente, chi produce materiale seminale congelato vorrebbe essere in grado di determinare il numero esatto di spermatozoi necessari ad ottenere la massima fertilità da ogni stallone, e poter pertanto produrre le dosi inseminanti sulla base di questa informazione. Purtroppo però, per identificare il numero esatto di spermatozoi necessari ad ottenere la massima fertilità da ogni stallone, bisognerebbe inseminare con dosi contenenti quantità diverse di spermatozoi un discreto numero di cavalle gestite nello steso modo. E’ evidente che il mettere in atto una procedura del genere comporterebbe costi inaccettabili per l’industria allevatoriale equina. Di conseguenza, i centri di produzione forniscono solitamente dosi inseminanti che contengono un numero di spermatozoi superiore a quello che è necessario per ottenere la massima fertilità per la maggior parte degli stalloni. Se si analizza infatti il grafico contenuto nella figura 1, risulta evidente che, nel caso in cui le dosi inseminanti di ogni soggetto preso in considerazione contenessero 300 milioni di spermatozoi progressivamente motili, si potrebbe ottenere la massima fertilità da tutti gli stalloni.

Quali altri fattori sono in grado di influenzare la probabilità che una fattrice risulti gravida dopo essere stata inseminata con il seme congelato di uno stallone?

Fino ad ora, in questo articolo, ci siamo concentrati principalmente sui fattori della fertilità inerenti al seme ed allo stallone; non dobbiamo trascurare però il fatto che per ottenere una gravidanza entrano in gioco altre variabili. In particolar modo, è necessario non dimenticare che la fertilità è il prodotto delle singole fertilità di fattrice e stallone (e quindi dei loro gameti).

Al momento attuale, purtroppo, l’unico test che consente di poter stabilire quale sia la fertilità del seme congelato (ma anche del seme fresco e refrigerato) di un determinato stallone è la prova biologica: ovvero la determinazione delle percentuali di gravidanza ottenute con l’utilizzo del suo materiale seminale.
Per dimostrare che uno stallone è più o meno fertile, un proprietario potrebbe riportare le percentuali di gravidanza ottenute dopo aver inseminato 5, 10 o 20 fattrici. Visto però che la fertilità ottenuta dopo inseminazione è una funzione binaria (gravida o non gravida), è come se si lanciasse una moneta (testa o croce). Quando si lancia una moneta e si misurano i risultati, si può notare che più volte la si lancia e più ci si avvicina alla possibilità di conseguire il risultato percentuale più reale (50%).

Analizziamo ora l’esempio di due stalloni (A e B) che hanno la stessa fertilità (50%) e che vengono utilizzati per inseminare 10 fattrici ciascuno. La fertilità che viene invece osservata utilizzando lo stallone A è del 70% (7 gravidanze su 10 cavalle) mentre quella dello stallone B è solo del 30%. Nonostante tutto però, da un punto di vista statistico, lo stallone A non è più fertile dello stallone B: questa imprecisione nella valutazione dei valori di fertilità è dovuta unicamente alle variazioni binarie. In altre parole, esiste la probabilità che, assegnando agli stessi stalloni A e B altre 10 fattrici da inseminare si verifichi l’esatto contrario, e cioè che lo stallone A possa ottenere 3 gravidanze su 10 e lo stallone B 7 su 10. L’unico modo per ottenere risultati che corrispondano il più possibile alla fertilità reale di uno stallone è pertanto quello di aumentare il numero di cavalle fecondate.

La matematica della fertilità

Al fine di comprendere questo esempio, dimentichiamoci totalmente dell’importante significato delle “altre variabili” e supponiamo che:

Fertilità Osservata = fertilità stallone x fertilità fattrice

Una fertilità ottenuta sul campo del 50% (0,50) può risultare dal fatto che uno stallone con il 55% di fertilità venga accoppiato con una cavalla che abbia il 90% di fertilità (0,55 x 0,9 = 0,49 o 49%) e viceversa. Anche nel caso in cui uno stallone estremamente fertile sia usato per “coprire” una fattrice molto fertile (entrambi con una fertilità del 90%) la probabilità che la fecondazione abbia luogo non sarà del 100%, bensì dell’81% (0,9 x 0,9 = 0,81 o 81%). Non dimentichiamo comunque che stiamo totalmente ignorando l’influenza delle “altre variabili” significative. Per esempio, accoppiare una fattrice anziana e presumibilmente sub-fertile con uno stallone sub-fertile (o con un seme di scarsa qualità) diminuisce di molto le probabilità di ottenere una gravidanza. Fertilità della cavalla (40% ) x fertilità dello stallone (40%) = 16% è la probabilità che si instauri una gravidanza.

Cosa significa tutto questo?

In conclusione si può affermare che:

• La fertilità è un fenomeno complesso che dipende da molti fattori, strettamente legati sia alle fattrici che agli stalloni. Molti di questi fattori sono già noti (ma resta comunque ancora difficile valutare il loro impatto sulla fertilità) mentre altri, probabilmente altrettanto importanti, restano ancora sconosciuti.
• Il numero ottimale di spermatozoi necessari ad ottenere una gravidanza è diverso per ogni stallone e pertanto i centri di produzione dovrebbero produrre dosi inseminanti che contengano un numero di spermatozoi superiore a quello minimo necessario ad ottenere la massima fertilità. Tutto ciò è necessario anche perché si deve tener conto di tutte le variabili di fertilità non controllabili che si osservano nell’attività pratica (cavalle anziane o meno fertili, materiale stoccato o scongelato utilizzando modalità non adeguate, etc.).
• Le procedure standard di laboratorio utilizzate per la valutazione qualitativa del materiale seminale possono essere fuorvianti o soggette ad errori sistematici o imprecisioni.
• La fertilità del materiale seminale non può essere garantita basandosi unicamente sulle analisi di laboratorio. Tutte le analisi effettuate in laboratorio misurano solo alcuni aspetti relativi all’integrità della cellula spermatica e non è detto che possano essere in grado di predire la sua fertilità.
• Lo scopo per cui si deve eseguire una valutazione qualitativa del materiale seminale è quello di misurare con precisione ed accuratamente tutte le caratteristiche spermatiche possibili, al fine di identificare gli stalloni od i lotti di seme che probabilmente avranno un basso livello di fertilità. Di conseguenza questi stalloni o questi lotti di materiale seminale dovrebbero essere eliminati dalla distribuzione commerciale. 
• I proprietari delle fattrici che prendono accordi per utilizzare il seme (refrigerato o congelato) di un determinato stallone dovrebbero essere a conoscenza dei numerosi fattori che sono in grado di influenzare i risultati. Acquisire materiale seminale congelato “a dose” e senza avere alcuna garanzia di fertilità o di qualità è un grosso rischio per il proprietario della fattrice. Nel caso in cui il seme sia venduto “a dose” il venditore dovrebbe assolutamente garantire che ogni dose inseminante contenga un numero minimo di spermatozoi ed abbia una percentuale minima di spermatozoi progressivamente motili post-scongelamento. SBS auspica che il seme congelato venga usato come uno strumento efficiente per “fornire” materiale seminale ad una cavalla, in modo da rispettare le condizioni di un contratto di acquisto che garantisca una gravidanza.

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