L’avvento del seme refrigerato ha cambiato in modo sostanziale la logistica dell’industria allevatoriale equina. Spedire il seme è molto più conveniente che inviare le fattrici dallo stallone ed ha obbligato i breeding managers ed i medici veterinari a cambiare il loro modo di gestire stalloni e fattrici. Inoltre, devono essere presi in considerazione molti fattori che possono influenzare il successo di questa tecnica, come ad esempio la gestione della raccolta del seme e la sua manipolazione, la formulazione dei diluitori, la diluizione, le curve di raffreddamento, il calcolo delle dosi inseminanti e le scatole di trasporto. Questo articolo descrive le tecniche di base che devono essere usate in modo adeguato per raccogliere il seme, per valutarlo e per prepararlo per la spedizione.
Iniziare con un Campione di Qualità Ottimale
Il primo aspetto da tenere in considerazione per produrre seme refrigerato di buona qualità è quello di ottenere un campione iniziale senza danneggiare gli spermatozoi durante i processi di raccolta e lavorazione. Anche se tutto ciò sembra ovvio, è invece molto comune trovare situazioni problematiche che derivano da errori che si sono verificati durante queste due fasi. Il campione seminale ideale da cui partire per preservare lo sperma equino (sia refrigerandolo che congelandolo) è quello che contiene una concentrazione elevata di spermatozoi (e quindi un rapporto ridotto fra plasma seminale e spermatozoi) e mostra una buona percentuale di spermatozoi progressivamente motili ed una percentuale ridotta di anomalie morfologiche. Questa condizione può essere ottenuta gestendo la frequenza con cui lo stallone viene raccolto, in modo che i giorni di riposo sessuale che precedono la raccolta di seme siano ideali per ottenere un eiaculato che abbia le caratteristiche ottimali e che limitino l’eccitazione dello stallone prima della raccolta. Idealmente lo stallone dovrebbe essere stimolato in modo appena sufficiente da stimolare una erezione ottimale che risulti in una eiaculazione dopo una sola monta, per evitare la presenza eccessiva di liquido pre-eiaculatorio. Questo fluido non contiene spermatozoi ed è tutto meno che il mezzo di cultura ideale dove incubarli.
Gli spermatozoi possono subire danni sub-letali a causa di situazioni diverse fra loro, quali:
1. Presenza di sostanze tossiche, quali sapone o minerali residuati dopo la pulizia dell’attrezzatura usata per la raccolta del seme. Questo fenomeno può essere evitato usando contenitori per il seme e guaine usa e getta per la vagina artificiale. Nel caso invece vengano impiegate guaine in lattice, si dovrebbe fare attenzione a pulirle e risciaquarle con acqua deionizzata, in modo da eliminare tutti i residui tossici.
2. Contaminazione del seme con lubrificanti idrosolubili ad elevata osmolarità. Questa evenienza può essere evitata usando minime quantità di lubrificanti idrosolubili e iso-osmotici rispetto al materiale seminale.
3. Shock termici derivanti dall’esposizione del seme a temperature troppo alte o troppo basse. Gli spermatozoi sono molto sensibili agli shock da freddo e da caldo e pertanto si dovrebbero prendere tutte le necessarie precauzioni per evitare, prima di mesolarli con un diluitore seminale, ogni variazione della temperatura da quella ottimale di 34-37C. Dopo che gli spermatozoi sono stati diluiti, bisognerebbe inoltre evitare di incubarli a 37C per periodi eccessivi in modo da evitare che la loro motilità subisca drastiche riduzioni.
4. Eccessiva contaminazione batterica. E’ assolutamente necessario evitare che il materiale seminale venga contaminato con batteri venendo a contatto con attrezzatura (vagina artificiale, manichino, etc) non sufficiente pulita.
Conta degli Spermatozoi
Dopo essere stato raccolto, il seme deve essere valutato per la concentrazione spermatica e per la motilità. Per diluire il seme in modo corretto è assolutamente necessario eseguire una valutazione della concentrazione spermatica il più accurata possibile. La concentrazione spermatica deve essere misurata dopo ogni raccolta di seme perchè può variare in modo considerevole fra un eiaculato e l’altro, in base alla frequenza delle monte ed alla stimolazione pre-eiaculatoria. La maggior parte dei laboratori utilizza fotometri di varie marche per misurare la concentrazione spermatica. Tutti i fotometri sono di facile utilizzo e molto veloci nell’eseguire la conta spermatica, anche se la loro precisione è ridotta se vengono impiegati per analizzare campioni di seme che sono al di fuori del range normale di 100 - 300 milioni di spermatozoi/ml. Al contrario, esiste invece un nuovo strumento che conta in modo diretto gli spermatozoi (Chemometec Nucleocounter SP-100) e che permette di eseguire rapidamente conte spermatiche in modo estremamente accurato. Il costo di questo strumento è comunque considerevolmente più elevato di quello di quasi tutti i fotometri presenti sul mercato.
Valutazione della Motilità Spermatica
La motilità spermatica è un buon indice per valutare lo stato di salute cellular e viene comunemente usata come indicatore della qualità del seme. La motilità spermatica può essere valutata in modo soggettivo da un tecnico ben addestrato, utilizzando un microscopio a contrasto di fase con tavolino riscaldato. In alternativa può essere invece impiegato un metodo oggettivo e più accurato che prevede l’uso di un analizzatore di motilità computerizzato: questo tipo di strumento può essere impiegato anche per valutare la velocità spermatica ed altri parametri di queste cellule.
Ogni dose inseminante dovrebbe contenere almeno 500 milioni di spermatozoi progressivamente motili 24 ore dopo la raccolta. Per calcolare quanti spermatozoi dovrebbero essere inizialmente inclusi in una dose inseminante per soddisfare i requisiti minimi richiesti dall’industria allevatoriale, è assolutamente necessario conoscere la motilità progressiva media dopo che il seme di ogni stallone viene mantenuto per 24 ore a 5°C. E comunque buona consuetudine, dopo aver spedito seme refrigerato, mantenere in laboratorio una dose refrigerata di ogni eiaculato, in modo da poterne valutare la qualità 24 e 48 ore dopo la raccolta. Sapere per quanto tempo il seme di uno stallone mantiene una buona motilità dopo la raccolta e la refrigerazione, permette di gestire al meglio ogni singolo riproduttore. Se, per esempio, il seme di uno stallone non mantiene una buona motilità per più di 18-24 ore, si può decidere di raccoglierlo nel tardo pomeriggio, piuttosto che al mattino presto. Se invece il materiale seminale di uno stallone non mantiene una buona motilità oltre le 12 ore, è assolutamente consigliabile non refrigerare e spedire il seme, ma inseminare solo fattrici che sono stabulate nel suo stesso allevamento. La motilità spermatica progressiva del seme diluito dovrebbe essere almeno del 30% dopo il suo mantenimento per 24 ore a 5°C.
Esistono altri metodi di laboratorio per valutare caratteristiche qualitative degli spermatozoi, che però non vengono solitamente impiegati nelle strutture dove viene prodotto seme refrigerato. I risultati che vengono ottenuti con il seme refrigerato dipendono dalla fertilità di stallone e fattrice e dalla capacità degli spermatozoi di un dato stallone di sopportare gli stress che si verificano durante le procedure di laboratorio e la refrigerazione. I fattori che più influiscono sulla qualità del seme refrigerato sono il tipo di diluitore, il fattore di diluizione, la curva di raffreddamento, il tipo di contenitore utilizzato per il trasporto, la temperatura a cui viene mantenuto il seme, il tempo di stoccaggio e la dose inseminante.
Diluitori
Benché in commercio ci siano numerosi diluitori per la refrigerazione del materiale seminale equino, la maggior parte di essi è costituita da formulazioni a base di latte magro e zucchero con quelli più comunemente usati che sono a base di latte magro e glucosio, conosciuto come diluitore di Kenney, che prende il nome dal suo ideatore, il dott. Bob Kenney. Questo tipo di diluitore con qualche variante della formula originale è usato al giorno d’oggi dalla maggior parte dei laboratori che lavorano seme refrigerato ed è disponibile con numerose diverse marche. La modifiche alla formula originale comprendono: aggiunta di zuccheri come il saccarosio ed il lattosio, diversi antibiotici e l’aggiunta di tamponi per contrastare le variazioni di pH. Più recentemente sono stati introdotti diluitori che contengono proteine raffinate del latte piuttosto che latte in polvere per la diluizione e la refrigerazione del materiale seminale equino. Questi diluitori sono stati sviluppati per poter disporre di medium contenenti solo i fosfocaseinati nativi del latte che è stato determinato costituiscono la frazione del latte che apporta i maggiori benefici per la sopravvivenza degli spermatozoi mentre sono rimosse quelle frazioni che non contribuiscono alla sopravvivenza degli stessi. Nella nostra esperienza ci sono alcuni particolari stalloni che traggono beneficio dall’uso di questi diluitori rispetto a quelli standard con latte scremato e glucosio mentre altri no. È quindi essenziale testare la sopravvivenza degli spermatozoi suddividendo un eiaculato di ciascun stallone nei diversi diluitori disponibili per determinare quale assicuri la maggior qualità spermatica dopo refrigerazione per 24-48 ore.
Diluizione
Il materiale seminale dello stallone è composto da diverse frazioni o getti che possono essere divisi in frazione ricca e frazione povera di spermatozoi. La frazione povera di spermatozoi contiene pochissimi spermatozoi e le secrezioni delle ghiandole sessuali accessorie come prostata e vescichette seminali. La frazione povera di spermatozoi costituisce la parte finale dell’eiaculato e durante la monta naturale gioca un ruolo importante nel mediare la risposta immunitaria del tratto genitale della cavalla. La frazione ricca di spermatozoi viene emessa nei primi getti (escluso il liquido pre – eiaculatorio) e contiene la maggior parte degli spermatozoi. Durante la monta naturale questi spermatozoi sono eiaculati direttamente attraverso la cervice uterina aperta della fattrice in estro, e rapidamente diluiti dai fluidi uterini e trasportati dalle contrazioni uterine verso l’apice delle corna uterine dove le cellule vitali guadagnano rapidamente l’accesso agli ovidutti lasciando indietro gli spermatozoi morti, il plasma seminale ed i detriti. In questo modo gli spermatozoi vengono esposti solo brevemente a grandi quantità di plasma seminale e non vi vengono incubati per lunghi periodi.
Il plasma seminale costituisce un pessimo diluitore per gli spermatozoi e ciò diviene evidente quando gli spermatozoi vengono refrigerati in presenza di troppo plasma seminale. E’ quindi necessario diluire ed allontanare adeguatamente il plasma seminale con un opportuno diluitore per assicurare la massima conservabilità degli spermatozoi. È stato dimostrato che la diluizione minima per preservare la motilità degli spermatozoi durante la conservazione a 5°C è di 3 parti di diluitore per 1 parte di seme. Diluizioni maggiori possono anche essere migliori ed il nostro obiettivo è di diluire il seme ad un minimo di 3:1 per ottenere una concentrazione finale di 30-50 milioni di spermatozoi per ml. In eiaculati molto concentrati ciò può significare diluire il seme addirittura fino a 11 o 12 :1.
Volumi maggiori di 60ml non sono auspicabili poiché la maggior parte del seme introdotto tornerebbe indietro in vagina attraverso la cervice uterina (aperta durante l’estro). Quindi se la concentrazione spermatica iniziale è bassa può essere necessario concentrare gli spermatozoi tramite centrifugazione prima della diluizione finale e della refrigerazione. Il seme può essere concentrato diluendo 1:1 con il diluitore per la refrigerazione, ponendo 40 ml di seme diluito in una provetta da 50ml e centrifugato a 350-400xg per 10-12 minuti. Dopo la centrifugazione, i 30ml di surnatante contenenti il diluitore ed il plasma seminale sono aspirati e viene aggiunto del nuovo diluitore per raggiungere la concentrazione finale desiderata per la refrigerazione. Usando questa tecnica vengono recuperati circa il 75% degli spermatozoi.
Una percentuale di recupero maggiore può essere ottenuta usando una tecnica di centrifugazione con “cuscino” in cui una piccola quantità di una preparazione densa, inerte a base di iodixanolo, viene stesa sotto al seme diluito sul fondo della provetta da centrifugazione e la centrifugazione è effettuata ad una forza g maggiore e per un periodo più lungo (1000x g per 20-30 minuti). Lo iodixanolo costituisce un “cuscino” per gli spermatozoi che si possono concentrare sul fondo senza danneggiarsi. Dopo la centrifugazione la maggior parte del surnatante ed il cuscino vengono rimossi ed il seme concentrato viene diluito per la refrigerazione. La rimozione della maggior parte del plasma seminale e la concentrazione degli spermatozoi con una di queste due tecniche può aumentare notevolmente il mantenimento della motilità spermatica per stalloni il cui eiaculato ha una bassa concentrazione spermatica e nei nostri laboratori è un protocollo standard per tutti gli eiaculati con una concentrazione iniziale inferiore a 120 milioni per ml.
Contenitori per la conservazione ed il trasporto
Il seme viene solitamente spedito con il servizio 24h e quindi la maggior parte delle fattrici viene inseminata con del seme raccolto 24-36 ore prima. I contenitori per il trasporto e la conservazione del seme refrigerato devono quindi mantenere la temperatura di 4-8°C per 36-48 ore. Questa è una considerazione molto importante quando si sceglie il tipo di contenitore.
L’Equitainer viene considerato il “gold standard” per la refrigerazione ed il trasporto del materiale seminale. La curva di raffreddamento è ottimale per il mantenimento della motilità spermatica e la capacità isolante nettamente superiore e la durata gli consentono una eccellente mantenimento della temperatura di conservazione in condizioni ambientali estreme. Esistono anche diversi tipi di scatole di polistirolo. Queste scatole hanno due vantaggi rispetto all’Equitainer: 1) sono meno costose e quindi solitamente non vengono rispedite al proprietario dello stallone per un riutilizzo e 2) la dose inseminante è precaricata in una siringa da 25 o 60 ml rendendo più semplice l’inseminazione per il veterinario fecondatore. La curva di refrigerazione ed il mantenimento della temperatura possono essere tuttavia inferiori in condizioni climatiche estreme rispetto all’Equitainer.
Benché la spedizione di seme refrigerato sia al giorno d’oggi relativamente diffusa, c’è ancora una considerevole variabilità nella qualità del seme che viene ricevuto. Ci si aspetta che la qualità del materiale seminale vari per fattori intrinseci da stallone a stallone, però può essere ridotta al minimo l’influenza di fattori esterni e l’obiettivo di chi gestisce lo stallone deve essere quella di produrre il miglior prodotto possibile.
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